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      飼料是畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)資料，飼料中蛋白質(zhì)含量是判定飼料營養(yǎng)價值的一項重要指標(biāo)，飼料中粗蛋白質(zhì)包括真蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分含氮物質(zhì)，后者主要包括游離氨基酸、硝酸鹽、氨等，故不能反映出飼料蛋白質(zhì)對動物的真正營養(yǎng)價值。目前，部分養(yǎng)殖場戶存在一個認識誤區(qū)，認為標(biāo)簽上標(biāo)注的粗蛋白質(zhì)高，營養(yǎng)價值就高。為此，部分飼料生產(chǎn)企業(yè)利用人們認識上的誤區(qū)，在飼料生產(chǎn)中添加羽毛粉、血粉、尿素等不易被動物肌體吸收的物質(zhì)，飼料產(chǎn)品中粗蛋白含量上去了，但卻沒有相應(yīng)的營養(yǎng)價值，造成養(yǎng)殖效益的低下。

真蛋白的檢測方法

1 適用范圍
　　本操作方法適用配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。
　　2 原理
　　樣品在水溶液中，加入過量硫酸銅，在堿性條件下，純蛋白被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮                物，沉淀部分按粗蛋白的測定方法測定其含氮量。
　　3 試劑
　　3.1 10%硫酸銅溶液：
　　稱取五水硫酸銅10g用水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容至刻度。
　　3.2 2.5%氫氧化鈉溶液：
　　稱取2.5g氫氧化鈉用水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容至刻度。
　　3.3 硫酸：化學(xué)純，含量為98%，無氮。
　　3.4 催化劑：0.4g硫酸銅，5個結(jié)晶水，6g硫酸鈉，均為化學(xué)純，磨碎混勻。
　　3.5 氫氧化鈉：化學(xué)純，40%水溶液（M/V）。
　　3.5.1 配制方法：
　　500g氫氧化鈉+1100ml蒸餾水。
　　3.6 硼酸：化學(xué)純，2%水溶液（M/V）。
　　3.6.1 配制方法：
　　20.5g硼酸+1000ml蒸餾水。
　　3.7 混合指示劑：
　　甲基紅，1%乙醇溶液，溴甲酚綠，0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個 月。
　　3.7.1 溴甲酚綠，0.5%乙醇溶液配置：
　　溴甲酚綠0.125g+25ml乙醇。
　　3.7.2 甲基紅，1%乙醇溶液配置：
　　甲基紅0.025g+25ml乙醇。
　　3.8 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定，按GB/T601制備。
　　3.8.1 0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.67ml鹽酸，分析純，注入1000ml蒸餾水中。
　　3.8.2 0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：8.3ml鹽酸，分析純，注入1000ml蒸餾水中。
　　3.9 硫酸銨：分析純，干燥。
　　3.10 蔗糖：分析純。
　　4 儀器設(shè)備
　　4.1 實驗室用樣品粉碎機。
　　4.2 分樣篩：孔徑0.45mm（40目）。
　　4.3 分析天平：感量0.0001g。
　　4.4 電爐。
　　4.5 滴定管：酸式，25、50ml。
　　4.6 凱氏燒瓶： 250ml。
　　4.7 凱氏蒸餾裝置：常量直接蒸餾式或半微量水蒸汽蒸餾式。
　　4.8 錐形瓶：250ml。
　　4.9 容量瓶：100ml。
　　4.10 燒杯：200ml。

　　4.11 干燥箱。
　　5 分析步驟
　　5.1 半微量法
　　5.1.1樣品的處理
　　稱取待測樣品0.5-1g（精確到0.1mg）于200ml（4.10）燒杯中，加入50ml蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，在電爐（4.4）上加熱煮沸，加入20ml 10%硫酸銅溶液（3.1），再加入20ml 2.5%氫氧化鈉溶液（3.2）攪勻，從電爐上取下，在室溫放置2h，然后用傾瀉法將樣品過濾到濾紙上，用少量溫水多次洗滌燒杯和沉淀物，直至洗出液無硫酸根離子（用10%氯化鋇溶液來檢驗濾液無沉淀），連同漏斗一起放入80℃干燥箱（4.11）中烘干，將濾紙和沉淀物小心放入250ml凱氏燒瓶（4.6）中，加入6.4g 催化劑（3.4），20ml 濃硫酸（3.3），在電爐（4.4）上消化，樣液澄清后繼續(xù)消煮2h，取下冷卻后加入20ml蒸餾水，轉(zhuǎn)入100ml 容量瓶（4.9）中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。同時做空白實驗。
　　5.1.2 蒸餾
　　將半微量蒸餾裝置（4.7）的冷凝管末端浸入裝有20ml 硼酸（3.6）的吸收液和2滴混合指示劑（3.7）的錐形瓶（4.8）內(nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10-20ml 注入蒸餾裝置中，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，同時用蒸餾水沖洗蒸餾裝置入口內(nèi)壁使樣品分析液和沖洗液一并流入反應(yīng)室，迅速將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min 降下錐形瓶使冷凝管末端離開液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。
　　5.1.3 滴定
　　蒸餾后的吸收液立即用0.02 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.1）滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。
　　5.2 常量法
　　5..2.1 稱取待測樣品0.5-1g（精確到0.1mg）于200ml（4.10）燒杯中，加50ml蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，在電爐（4.4）上加熱煮沸，加入20ml10%硫酸銅溶液（3.1），再加入20ml2.5%氫氧化鈉溶液（3.2）攪勻，從電爐上取下，在室溫放置2h，然后用傾瀉法將樣品過濾到濾紙上，用少量溫水多次滌燒杯和沉淀物，直至洗出液無硫酸根離子（10%氯化鋇溶液來檢驗濾液無沉淀），連同漏斗一起放入80℃干燥箱內(nèi)烘干，將濾液和沉淀物小心放入250ml凱氏燒瓶（4.6）中，加入6.4g催化劑（3.4），20ml濃硫酸（3.3），在電爐上消化，樣液澄清后繼續(xù)消煮2h，取下放冷后加入60-100ml蒸餾水，搖勻冷卻。同時做空白實驗。
　　5.2.2 將蒸餾裝置（4.7）的冷凝管末浸入裝有25ml硼酸（3.6）吸收液和2滴混合指示劑（3.7）的錐形瓶內(nèi)。然后小心的向凱氏燒瓶（4.6）中加入50ml氫氧化鈉溶液，輕輕搖動凱氏燒瓶，使溶液混勻后再加熱蒸餾，直至流出液為100ml，降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾1-2min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。
　　5.2.3 滴定
　　蒸餾后的吸收液立即用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.2）滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。
　　5.3蒸餾步驟的檢驗
　　精確稱取0.2g硫酸銨（3.9）代替試樣，按5.1或5.2步驟進行操作，測得硫酸銨含氮量為21.19±0.2%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。
　　5.4空白測定
　　稱取蔗糖（3.10）0.5g，代替試樣，按5.1或5.2步驟進行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.2）的體積不得超過0.2ml。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.8.1）體積不得超過0.3ml。
　　6 分析結(jié)果的表述
　　6.1計算見下式：
　　真蛋白（%）=(V1-V2)×C×0.0140×6.25×100
　　m×V′/V
　　式中：V1-滴定試樣時所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
　　V2-滴定空白時所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
　　C-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；
　　V-試樣分解液的總體積，ml；
　　V′-試樣分解液蒸餾用體積，ml；
　　0.0140-每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；
　　6.25-氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。
　　6.2 重復(fù)性
　　每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術(shù)平均值為結(jié)果。
　　當(dāng)真蛋白含量在25%以上時，允許相對偏差為1%。
　　當(dāng)真蛋白含量在10%-25%之間時，允許相對偏差為2%。
　　當(dāng)真蛋白含量在10%以下時，允許相對偏差為3%。
　　7 關(guān)鍵步驟及注意事項
　　7.1 傾瀉法過濾洗滌時，燒杯中的沉淀物一定要徹底清洗。室溫較低時洗滌用水的溫度要稍微高一點，以保證燒杯中的沉淀物徹底轉(zhuǎn)移。
　　7.2 過濾時的濾液達到400ml后再用10%的氯化鋇溶液檢驗濾液是否有沉淀，這樣可以減少檢驗次數(shù)。
　　7.3烘干沉淀時，可將濾液倒掉，將漏斗和盛放濾液的容器同時放入干燥箱，以免漏斗放置不穩(wěn)沉淀物遺失。
　　7.4加入混合催化劑在電爐上消化時，要時刻觀察樣液的顏色變化（有些單一飼料中含雜質(zhì)較多不易觀察顏色），樣液徹底澄清后再計時繼續(xù)消煮2h。
　　7.5半微量法測定真蛋白轉(zhuǎn)移時要遵循少量多次的原則，一方面轉(zhuǎn)移的溶液體積不超過100ml ，也要做到轉(zhuǎn)移徹底。

      進口魚粉中真蛋白與初蛋白的比列為80%，國產(chǎn)魚粉中真蛋白與粗蛋白的比列為75%

      植物性蛋白真蛋白與粗蛋白的比列基本接近1