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        摘要：本試驗(yàn)分別用0、15%、30%、45%、60%的生物飼料酵母替代飼料中0、17%、34%、51%、68%的魚粉，配制五種等氮、等能的試驗(yàn)飼料,分別表示為Ⅰ組（對(duì)照組）、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組。飼養(yǎng)大菱鲆56d后，研究生物飼料酵母替代魚粉后對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)及免疫機(jī)能的影響。結(jié)果表明，隨飼料酵母替代比例的增加，增重率（WGR）和特定生長(zhǎng)率（SGR）沒有顯著差異（P＞0.05），蛋白質(zhì)效率（PER）、肝體指數(shù)（HSI）和內(nèi)臟指數(shù)（VSI）均逐漸降低（P＜0.05），飼料系數(shù)（FCR）逐漸增高（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅳ組的成活率（SR）均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而Ⅴ組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。Ⅱ組和Ⅴ組的肥滿度(CF)與對(duì)照組沒有顯著差異（P＞0.05），Ⅲ組和Ⅳ組分別顯著高于對(duì)照組15.7%和15.7%（P＜0.05）。魚體的水分和脂肪隨著替代比例的增加沒有發(fā)生顯著的變化（P＞0.05），而粗蛋白含量逐漸降低（P＜0.05），粗灰分則逐漸升高（P＜0.05）。血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性和血清中蛋白的含量也隨著替代比例的增加而減少，殺菌活性沒有顯著的差異（P＞0.05），而堿性磷酸酶活性則出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中較高比例的生物飼料酵母替代魚粉會(huì)降低大菱鲆的生長(zhǎng)性能，并干擾其脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。綜合考慮大菱鲆的生長(zhǎng)指標(biāo)、形體指標(biāo)、魚體成分和免疫機(jī)能等因素，要獲得最佳的養(yǎng)殖效益，牙鲆飼料中的添加量以17%為宜。

　　關(guān)鍵詞：大菱鲆；生物飼料酵母；生長(zhǎng)性能；免疫機(jī)能

　　前言

　　眾所周知，在水產(chǎn)動(dòng)物的飼料原料中，最緊缺的就是飼料蛋白源，積極開發(fā)飼料蛋白源具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前對(duì)漁用蛋白源的研究及開發(fā)利用主要集中在動(dòng)物性蛋白源、植物性蛋白源、單細(xì)胞蛋白源等幾個(gè)方面。飼料酵母（feed yeast）[1-2]屬單細(xì)胞蛋白，是用酒精廢液、味精廢液、亞硫酸紙漿廢液、石蠟油或糖蜜等作原料，以熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）為菌種，在發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)培養(yǎng)繁殖而獲得的菌體濃縮物。蛋白質(zhì)含量45%～60%[3]，氨基酸種類齊全，富含B族維生素，還有豐富的酶系和多種活性物質(zhì)，如：輔酶A、輔酶Q、細(xì)胞色素C、凝血質(zhì)、谷胱甘肽、卵磷脂、麥角固醇和核糖核酸等。本試驗(yàn)所使用的飼料酵母是以淀粉企業(yè)生產(chǎn)淀粉和葡萄糖的副產(chǎn)物為底物，以產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）為菌種，經(jīng)過(guò)一系列的發(fā)酵、蒸干、噴霧干燥等工藝加工而成。該飼料酵母蛋白質(zhì)含量可達(dá)46%，細(xì)胞總數(shù)約為160億/g，粗脂肪為3%，核酸為8%，賴氨酸含量較高，蛋氨酸含量較少，營(yíng)養(yǎng)十分豐富。如能充分利用該飼料酵母作為蛋白源最大限度的替代魚粉，不僅可以減少魚粉的使用，降低生產(chǎn)成本；還能充分利用我國(guó)玉米深加工的副產(chǎn)物資源，解決資源再利用的問題。

　　目前，關(guān)于飼料酵母對(duì)魚類的影響已經(jīng)在多種魚類上進(jìn)行了相關(guān)的研究，研究的內(nèi)容多集中在飼料酵母替代魚粉后對(duì)魚類的生長(zhǎng)、飼料利用等[3-7]的研究。研究的對(duì)象多集中在鯉魚(Cyprinus carpio) [4]、建鯉(Cyprinus carpiovar jian)[5]、羅非魚（Tilapia）[7]、淡水白鯧（Freshwater orbfish）[8]上，對(duì)大菱鲆的研究還很少。大菱鲆（Scophthatmus maximus）英文名Turbot，在中國(guó)俗稱為“多寶魚”，是一種底棲的肉食性魚類，它易于被馴服、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩、口感獨(dú)特，是我省乃至我國(guó)重點(diǎn)養(yǎng)殖品種，也是養(yǎng)殖產(chǎn)量較大的品種之一。大菱鲆對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的需求量很高，蛋白含量低于39%時(shí)，幼魚增長(zhǎng)緩慢，只有蛋白含量高于42%時(shí)，大菱鲆幼魚才會(huì)快速增長(zhǎng)[9]。

　　因此，針對(duì)大菱鲆研究飼料酵母在其飼料中的應(yīng)用，具有典型的代表作用。本研究通過(guò)營(yíng)養(yǎng)學(xué)和免疫學(xué)方法探索生物飼料酵母替代魚粉的可行性及其在大菱鲆飼料中適宜的添加比例，為生物飼料酵母的應(yīng)用提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)飼料的配制

　　試驗(yàn)所用魚粉為粗蛋白為68%的秘魯魚粉，生物飼料酵母由秦皇島驪驊淀粉股份有限公司生產(chǎn)、提供，粗蛋白含量為48.3%，按照不同的替代比例設(shè)計(jì)5種不同的飼料配方，Ⅰ組為對(duì)照組，不添加飼料酵母，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組分別含有15%、30%、45%和60%的飼料酵母，相應(yīng)替代17%、34%、51%和68%的魚粉。飼料配方及飼料常規(guī)成分見表1。根據(jù)飼料配方將所有飼料原料用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎過(guò)80目篩、混勻,用F-26型雙螺桿擠條機(jī)（華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠制造）制成1.5mm的硬顆粒飼料, 70℃干燥后裝袋密封后于-20℃冰箱保存,備用。

　　注：其它（%）：磷蝦粉,2；玉米淀粉，5;復(fù)合礦物鹽，0.5；復(fù)合維生素，2；膽堿，0.5；Vc磷酸酯，0.4；CMC，1; Y2O3,0.01.

　　復(fù)合礦物鹽(g/Kg)：氯化鈷，0.04；硫酸銅，2.5；硫酸亞鐵，40；硫酸鎂，283.98；硫酸錳，6.5；碘化鉀，0.67；亞硒酸鈉，0.1；硫酸鋅，131.93；填充物，534.28；

　　復(fù)合維生素(g/Kg)：鹽酸硫氨素，0.5；核黃素，3；VB6，1；煙酸，5；肌醇，5；泛酸鈣，5；生物素，0.05；葉酸，0.18；VK3，2；VB12，0.002；VA醋酸鹽(20,000IU/g)，5；VD3，(400,000IU/g)，0.002；VE，(250IU/g)，8；纖維素，865.266.

　　1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

　　大菱鲆幼魚購(gòu)于秦皇島天合水產(chǎn)良種有限公司，平均體重為（9.02±0.15g）、平均體長(zhǎng)為（6.10±0.06cm），采用單因素完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì), 200尾大菱鲆幼魚,隨機(jī)分為 5 個(gè)組,每組 3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)13尾魚。飼養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)流水的水族箱（120L）中 , 以試驗(yàn)飼料馴化10d，待魚適應(yīng)后，開始試驗(yàn)。保持微流水狀態(tài),水溫（18 .0±1.0）℃, pH（7.6±0.4），溶氧大于8 mg /L，鹽度為（30.60±0.02）。每天飼喂 3次（7:00、12:00和18:00）,投飼率為體重的3 %~ 4% ,每 14 d調(diào)整投喂量。試驗(yàn)持續(xù)56d。

　　1.3 樣品采集與分析

　　試驗(yàn)結(jié)束后,禁食1d稱重,每箱隨機(jī)取3尾魚再次稱重后,于105℃ 烘干(A.O.A.C.)[10],用微型粉碎機(jī)粉碎、稱重,裝入密封袋中于-20℃冰箱中冷凍保存,用于全魚粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量[11-12]的分析。另隨機(jī)從每箱隨機(jī)取3尾魚,麻醉處理后,測(cè)體長(zhǎng)和體重,然后用2.5mL一次性無(wú)菌注射器（含肝素鈉）從心臟采血,置于4℃冰箱過(guò)夜,以3000r/min于4℃下離心10min,分離血漿,收集的血漿保存于-80℃冰箱待測(cè)。

　　1.3.1 體成分的測(cè)定

　　飼料及魚體成分均采用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定：干物質(zhì)采用105℃烘箱干燥法；灰分采用馬弗爐灼燒法（550℃）；粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法;粗脂肪采用索氏抽提法(以石油醚為溶劑)[13] 。

　　1.3.2 生化指標(biāo)的測(cè)定

　　血清中的總蛋白采用考馬斯亮藍(lán)染色法，超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法，以上指標(biāo)均用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。溶菌酶活性的測(cè)定是將溶壁微球菌溶于0.02M醋酸緩沖液制成0.025%w/v的菌懸液，將溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)樣用0.02M醋酸緩沖液稀釋成0、2、4、6、8、10μg/ml等不同濃度的稀釋液，各取15μl分別加入250μl菌懸液，在0min讀取450nm處吸光值A(chǔ)0，37℃孵育20min后，再次讀取450nm處的吸光值A(chǔ)，以溶菌酶稀釋液為橫坐標(biāo)，以（A0 –A）為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，血清的測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致，將15μl血清樣本加入250μl菌懸液，測(cè)其(A0-A)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其相應(yīng)的溶菌酶濃度。殺菌活性的測(cè)定采用大腸桿菌為底物，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，用1/15M pH=6.4 PBS洗滌成菌懸液，使其OD570≈0.3。取2ml配置好的大腸桿菌菌懸液放入試管中，加入20μl血清混勻，測(cè)其A0，然后將試管移入37℃水浴30min取出后立即冰浴10min，測(cè)其A。則UL=[(A0-A）/ A0]1/2。

　　1.4 數(shù)據(jù)處理

　　試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示, 采用SPSS（17.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(One-way ANOVA) ,若組間差異顯著,再用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,顯著水平為 0.05。

　　2 結(jié)果

　　2.1 不同比例的生物飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能的影響

　　由表2可見，生物飼料酵母替代魚粉的比例在68%以下時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組的增重率（WGR）和特定生長(zhǎng)率（SGR）均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但是Ⅱ組WGR和SGR均顯著高于Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組（P＜0.05），Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組之間并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。對(duì)照組的飼料系數(shù)（FCR）和蛋白質(zhì)效率（PER）與Ⅱ組和Ⅲ組的組間差異不顯著，與Ⅴ組差異顯著（P＜0.05）。Ⅱ組和Ⅳ組的SR均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而Ⅴ組顯著低于對(duì)照組12.1%（P＜0.05）。結(jié)果表明，飼料中用飼料酵母替代魚粉17%~51%時(shí)，對(duì)大菱鲆的生長(zhǎng)性能沒有顯著性的影響，但是51%替代時(shí)，雖SR與17%替代組相差不大（P＞0.05），但WGR、SGR和PER顯著低于17%替代組，。34%替代時(shí)，雖然WGR、SGR、FCR和PER都和對(duì)照組差別不大，但其SR卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于17%替代組。

　　注：增重率(WGR， %) = 100 ×(末體質(zhì)量 - 初體質(zhì)量) /初體質(zhì)量;特定生長(zhǎng)率 (SGR， %/ d) = 100 ×( l n 終末體重 -l n 初始體重) /試驗(yàn)天數(shù);成活率（SR ，%）=(試驗(yàn)結(jié)束魚尾數(shù)/試驗(yàn)開始魚尾數(shù))×100;飼料系數(shù)（FCR） =攝食飼料總量/魚體增重量;蛋白質(zhì)效率（PER） =魚體增重量/蛋白質(zhì)攝取量;

　　2.2 不同比例的生物飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆形體指標(biāo)的影響

　　由表3發(fā)現(xiàn)，隨著飼料酵母替代魚粉比例的增加，肝體指數(shù)（HSI）和內(nèi)臟指數(shù)（VSI）均逐漸下降，Ⅱ組與Ⅲ組的HSI分別顯著高于對(duì)照組45.4%和38.1%（P＜0.05），Ⅳ組與對(duì)照組沒有顯著差異（P＞0.05），而Ⅴ組的HS I顯著低于對(duì)照組69.2%（P＜0.05）。Ⅱ組的VSI顯著高于對(duì)照組24.6%（P＜0.05）, Ⅲ組和Ⅳ組的VSI與對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05），而Ⅴ組顯著低于對(duì)照組3.7%（P＜0.05）。Ⅱ組和Ⅴ組的CF與對(duì)照組沒有顯著差異（P＞0.05），Ⅲ組和Ⅳ組分別顯著高于對(duì)照組15.7%和13.4%（P＜0.05）

　　2.3 不同比例的生物飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆體成分的影響

　　由表4可知，全魚水分的含量隨著替代比例的增加沒有顯著性差異（P＞0.05），但Ⅱ組的水分含量最低；隨著生物飼料酵母替代魚粉的比例的不斷增加，粗蛋白的含量產(chǎn)生了顯著的差異，Ⅲ組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），Ⅱ組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅳ組和Ⅴ組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。粗脂肪的含量Ⅳ組最高，Ⅲ組次之，Ⅱ組最低，但各組間差異不明顯（P＞0.05）。Ⅳ組和Ⅴ組的灰分含量差異不明顯，其他各組差異顯著（P＜0.05），Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組分別顯著高于Ⅱ組29.10%，45.60%，57.53%和58.72%。

　　2.4 不同比例的生物飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆免疫機(jī)能的影響

　　由表5可以看出，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的溶菌酶的活性與Ⅳ組、Ⅴ組的差異顯著（P＜0.05），但Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組之間、Ⅳ組和Ⅴ組之間均無(wú)顯著性的差異（P＞0.05）。隨著替代比例的增加，殺菌活性差異不明顯（P＞0.05）。AKP活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組無(wú)顯著性差異，但Ⅲ組與Ⅳ組、Ⅴ組差異顯著。SOD呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，血清中的蛋白含量Ⅱ組最高，其他組逐漸降低。

　　注：100ml血清在37℃與基準(zhǔn)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)金氏單位。

　　3 討論

　　本試驗(yàn)中，飼料中添加17%的生物飼料酵母時(shí)，大菱鲆的生長(zhǎng)性能最佳，這與張梁[7]網(wǎng)箱養(yǎng)殖淡水白鯧的結(jié)果相同。諸多研究表明[14-17]，飼料酵母部分或全部替代魚粉應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物上是可行的，但是要根據(jù)養(yǎng)殖種類和魚類食性的差異，調(diào)整飼料配方，滿足魚類營(yíng)養(yǎng)的需要。

　　生物飼料酵母替代魚粉應(yīng)用在大菱鲆的飼料中，結(jié)果表明，隨生物飼料酵母替代魚粉比例的增加，大菱鲆的增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）和蛋白質(zhì)效率（PER）隨之下降，表明高比例的飼料酵母不利于大菱鲆的生長(zhǎng)，可能是試驗(yàn)對(duì)象為幼魚，需要較多的能量來(lái)滿足魚體的生長(zhǎng)，當(dāng)飼料酵母增多時(shí)，幼魚難于消化，飼料中可消化能減少的緣故。但葛樹立[7]用活性酵母養(yǎng)殖羅非魚時(shí)，隨著替代比例的增加，WGR增加，F(xiàn)CR降低，表明活性酵母明顯促進(jìn)羅飛魚(Tilapia)的生長(zhǎng)。這可能與養(yǎng)殖品種、酵母的來(lái)源、組成等有關(guān)。較高的飼料酵母替代魚粉也同樣降低了鯉魚[4] 、淡水白鯧[8]、胡子鯰[18]的攝食和生長(zhǎng)，也可能是高濃度的飼料酵母引起魚體的免疫反應(yīng)過(guò)度，導(dǎo)致用于生長(zhǎng)的能量和營(yíng)養(yǎng)素減少。Rumsey等[19 ]則認(rèn)為完整的酵母細(xì)胞無(wú)法使胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分釋放出來(lái)而被魚類利用是高含量酵母能力較差的原因。

　　幼魚的消化系統(tǒng)發(fā)育不及成魚完善，對(duì)各種環(huán)境因子尤其是食物因子的變化反應(yīng)比較敏感，當(dāng)飼料中大量添加生物飼料酵母時(shí)，可能會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，肝體指數(shù)（HSI）和內(nèi)臟指數(shù)（VSI）等會(huì)發(fā)生較大變化。在本試驗(yàn)中，Ⅱ組和Ⅲ組的HIS、VSI和CF均高于對(duì)照組，說(shuō)明一定比例的飼料酵母會(huì)刺激魚體形體的生長(zhǎng)，改善肝功能，但黃鈞[6]用加酶飼料酵母替代魚粉飼養(yǎng)豐鯉時(shí)，魚粉組的CF顯著高于各飼料酵母替代組。

　　本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨生物飼料酵母替代魚粉比例的增加，水分和脂肪含量無(wú)明顯變化，粗蛋白含量逐漸降低，而灰分的含量逐漸升高。而程光平[17]用酵母蛋白替代魚粉飼養(yǎng)胡子鯰，測(cè)定其水分、粗蛋白、粗灰分和氨基酸總量時(shí)，與魚粉組均沒有差異。當(dāng)飼料酵母替代魚粉超過(guò)51%時(shí)，粗蛋白的含量顯著下降，表明高比例的生物飼料酵母替代魚粉會(huì)影響蛋白質(zhì)在魚體內(nèi)的沉積，這與高含量飼料酵母組的飼料利用率較低有關(guān)。從總體來(lái)看，Ⅱ組的粗蛋白含量最高，顯著高于對(duì)照組，而其粗脂肪含量又最低，說(shuō)明飼料中添加17%的生物飼料酵母能夠增加魚的蛋白含量，減少脂肪的堆積，能顯著提高魚肉的品質(zhì)，使魚肉更加鮮嫩可口。

　　溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的許多組織和體液中，是能否殺滅病原菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，血清中的溶酶菌主要來(lái)自血細(xì)胞中，是一種堿性球蛋白，能夠?qū)Ｒ恍缘厮怆亩嗵欠肿又?beta;-1,4糖苷鍵，從而破壞并裂解細(xì)胞壁，最終使細(xì)菌死亡，實(shí)現(xiàn)其機(jī)體防御的功能[20-21]。測(cè)定魚體的溶菌酶活性，可以一定程度上反映魚類非特異性體液免疫狀態(tài)。在本試驗(yàn)中，溶菌酶的活性在添加17%生物飼料酵母時(shí)最高，增加飼料酵母的添加量，溶菌酶活性反而降低，說(shuō)明高濃度的生物飼料酵母對(duì)溶菌酶的活性可能具有抑制作用。

　　超氧化物歧化酶具有催化超氧離子自由基進(jìn)行歧化反應(yīng)的功能，是機(jī)體清除氧自由基的重要抗氧化保護(hù)酶，它能促使自由基的形成和使清除處于動(dòng)態(tài)平衡，從而清除自由基對(duì)機(jī)體的危害，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng) SOD活性降低時(shí)，其自由基等毒害物質(zhì)就會(huì)積累。在本試驗(yàn)中，血清中的蛋白含量和超氧化物岐化酶（SOD）也都隨著飼料酵母添加比例的增加而減少，說(shuō)明添加高比例的飼料酵母可以減弱機(jī)體的免疫能力，這可能也是導(dǎo)致高替代組死亡率增加的重要原因之一。

　　綜上所述，由飼料酵母替代飼料中17%左右的魚粉可以使大菱鲆的生長(zhǎng)、成活率、機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分和免疫機(jī)能優(yōu)于其他各組。